เราเสนอ KcsA, โพแทสเซียมแชนเนลช่อง K ของ streptomyces A, ไอออนแชนแนล, โปรตีนที่ปราศจากเซลล์ที่แยกได้โดย nanodiscs, ขึ้นอยู่กับ E.coli lysates สำหรับการแสดงออกที่ปราศจากเซลล์

โปรตีนที่ปราศจากเซลล์ของเราได้รับแล้วฟังก์ชั่นการตรวจสอบ

บทนำ

KCSA (K channel of streptomyces A) เป็นโพแทสเซียมโพแทสเซียมจากแบคทีเรียในดิน Streptomyces lividansที่ได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวางในการวิจัยช่องไอออนโปรตีนที่มีค่า pH เปิดใช้งานนั้นมีสองส่วนของเมมเบรนและบริเวณรูขุมขนที่เลือกได้สูงซึ่งมีหน้าที่ในการสร้าง gating และ shuttling ของ K⁺ไอออนออกจากเซลล์ลำดับกรดอะมิโนที่พบในตัวกรองการเลือกของ KcsA นั้นได้รับการอนุรักษ์อย่างมากในหมู่ทั้ง prokaryotic และ eukaryotic K⁺ช่องทางแรงดันไฟฟ้า;เป็นผลให้การวิจัยเกี่ยวกับ KcsA ได้ให้ความรู้ความเข้าใจโครงสร้างและกลไกที่สำคัญในระดับโมเลกุลสำหรับ K⁺การเลือกและการนำไอออนในฐานะที่เป็นหนึ่งในช่องทางไอออนที่ได้รับการศึกษามากที่สุดในทุกวันนี้ KcsA จึงเป็นเทมเพลตสำหรับการวิจัยเกี่ยวกับ K⁺ ฟังก์ชั่นช่องทางและโครงสร้างที่อธิบายไว้ภายใต้การสร้างแบบจำลองการคำนวณของการเปลี่ยนแปลงช่องทางสำหรับทั้งสายพันธุ์ prokaryotic และยูคาริโอต

ฟังก์ชัน

แชนเนล KcsA ถือเป็นแชเนลโมเดลเนื่องจากโครงสร้าง KcsA จัดเตรียมเฟรมเวิร์กสำหรับการทำความเข้าใจ K⁺ช่องสัญญาณการนำทางซึ่งมีสามส่วน: หัวกะทิโพแทสเซียมช่องทางประตูโดยไว pH และการปิดช่องแรงดันไฟฟ้ารั้วรอบขอบชิดK⁺การซึมผ่านของไอออนเกิดขึ้นที่บริเวณฟิลเตอร์หัวกะทิบนของรูขุมขนในขณะที่ค่าความเป็นกรด - ด่างของเลือดเพิ่มขึ้นจากการที่โปรตอนของเอมเทมเบรนอยู่ที่ปลายรูขุมขนที่ค่าความเป็นกรดด่างต่ำส่วนเกลียว M2 จะถูกโปรตอนเปลี่ยนช่องไอออนจากโครงสร้างปิดเป็นโครงสร้างเปิดเมื่อไอออนไหลผ่านช่องทางกลไกการเหนี่ยวนำแรงดันไฟฟ้ามีความคิดที่จะชักนำให้เกิดปฏิกิริยาระหว่าง Glu71 และ Asp80 ในตัวกรองแบบเลือกซึ่งทำให้การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างสื่อกระแสไฟฟ้าเป็นไปอย่างไม่เสถียรและอำนวยความสะดวกในการเข้าสู่สถานะ ช่องทางขึ้นอยู่กับ

ในโครงสร้างที่ไม่เป็นตัวนำของ KcsA ที่ pH 7, K⁺ผูกพันอย่างแน่นหนากับการประสาน oxygens ของตัวกรองการเลือกและเอนจิน TM2 ทั้งสี่มาบรรจบกันใกล้กับทางแยกไซโตพลาสซึมเพื่อป้องกันการผ่านของโพแทสเซียมไอออนอย่างไรก็ตามที่ค่า pH 4 KcsA ผ่านการเปลี่ยนรูปแบบการแลกเปลี่ยนตัวกรองเป็นระยะเวลาหนึ่งถึงสองพันวินาทีและสถานะไม่อิ่มตัวและระหว่างการเปิดและปิดการทำงานของ M2 helicesในขณะที่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่แตกต่างกันเหล่านี้เกิดขึ้นในบริเวณที่แยกจากกันของช่องทางพฤติกรรมโมเลกุลของแต่ละภูมิภาคจะถูกเชื่อมโยงโดยทั้งการโต้ตอบไฟฟ้าสถิตและอัลโลยีพลวัตของการกำหนดค่า stereochemical แลกเปลี่ยนในตัวกรองนี้ให้พื้นฐานทางกายภาพสำหรับ K พร้อมกัน⁺ สื่อกระแสไฟฟ้าและประตู

Stucture

ด้วยการเกิดขึ้นของโครงสร้างผลึก (0.32 นาโนเมตร) ของแบคทีเรีย (Streptomyces lividans) โพแทสเซียมช่องทาง KcsA ซึ่งเป็น keystone สำหรับโครงสร้างช่องไอออนได้รับการส่งมอบแล้วโทโพโลยีของมันได้รับการระบุว่าเป็นบิตที่มีเกลียวด้านในและด้านนอกเอนริเก้ทั้งสองเชื่อมโยงกันโดย“ รูขุมขน” และฟิลเตอร์คัดแยกหน่วยย่อยทั้งสี่สร้างช่องทางโดยการปูทางเดินให้ไอออนข้าม bilayerทางเดินของไอออนสามารถอธิบายได้ว่าผ่านประตูด้านไซโตพลาสซึมและเคลื่อนไปสู่ส่วนหน้าซึ่งทำให้ไอออนมีความเสถียรผ่านช่วงไดโพลของเกลียวด้านในที่เรียกว่าไอออนจะต้องผ่านฟิลเตอร์หัวกะทิในท่าทางที่เคลื่อนไหวพร้อมกับโพแทสเซียมไอออนที่อยู่ในตัวกรองแล้วด้วยความสามารถในการเลือกสูง KcsA จึงแสดงความคล้ายคลึงกันกับช่องสัญญาณ K แรงดันไฟฟ้า (Kv) ในแง่ของการซึมผ่านของไอออนและความคล้ายคลึงกันในทอพอโลยีที่มีช่องสัญญาณขาเข้า K เพื่อแก้ไขสิ่งสำคัญที่ควรทราบคือช่อง KcsA เกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงค่า pHการถอดรหัสสาเหตุของการเลือกสรรจำนวนมหาศาลของ K channel สำหรับโพแทสเซียมมากกว่าโซเดียมเป็นความท้าทายที่ทันสมัยคาดว่าโครงสร้างของ KcsA จะเป็นเวทีปิดด้วยโครงสร้าง (0.33 นาโนเมตร) ของโปรคาริโอต (Methanobacterium thermoautotrophicum)ในระหว่างการเปิดใช้งานหูฟังด้านในจะผลักรัศมีออกไปด้านนอกและเปิดการรัดบริเวณด้านไซโตพลาสซึมการเปิดนี้มาพร้อมกับบานพับรอบ glycine ตกค้างที่ตำแหน่ง 99 (G99)นี่คือการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่เด่นชัดที่สุดที่อธิบายไว้สำหรับช่องไอออนตัวกรองการเลือกยังคงไม่เปลี่ยนแปลงในตำแหน่งโครงสร้างและส่วนนอกของเกลียวนั้นผ่านการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเล็กน้อยเป็นบทสรุปสำหรับบริบทของการตรวจสอบนี้และในส่วนที่เกี่ยวกับการค้นพบสำหรับ Vpu ที่เกี่ยวข้องกับ KcsA

ข้อได้เปรียบของระบบ E.Coli

1. ให้โปรตีนสูง
2. การปลูกง่ายและการเจริญเติบโตของเซลล์อย่างรวดเร็ว
3. ต้นทุนที่มีประสิทธิภาพ
4. พันธุวิศวกรรมง่าย
5. ที่ดีขึ้น